Назначение

CFX96 Touch предназначен для проведения полимеразной цепной реакции с регистрацией флуоресцентного сигнала непосредственно во время амплификации.

Система может применяться для:

• качественного выявления нуклеиновых кислот;
• количественного определения ДНК;
• количественного определения РНК после стадии обратной транскрипции;
• оценки экспрессии генов;
• генотипирования;
• аллельной дискриминации;
• анализа точечных мутаций;
• исследований по конечной точке;
• анализа кривых плавления;
• мультиплексной ПЦР;
• оптимизации условий амплификации.

Применение для медицинской диагностики определяется инструкцией конкретной зарегистрированной тест-системы.

Конструкция системы

CFX96 Touch состоит из двух основных функциональных частей:

• термоциклер C1000 Touch;
• оптический реакционный модуль CFX96.

Термоциклер обеспечивает программируемое изменение температуры реакционного блока, а оптический модуль регистрирует флуоресценцию в каждой из 96 реакционных ячеек.

Такая модульная архитектура позволяет сочетать высокоточное температурное управление и многоканальную оптическую детекцию.

Формат образцов

Система рассчитана на 96 реакционных позиций.

Применяются совместимые:

• 96-луночные низкопрофильные ПЦР-планшеты;
• стрипы по 8 пробирок;
• отдельные пробирки 0,2 мл с соответствующей рамкой;
• оптически прозрачные крышки;
• оптические герметизирующие плёнки.

Для Real-Time PCR предпочтительно использовать белые или рекомендованные производителем реакционные ёмкости, обеспечивающие эффективное отражение флуоресцентного сигнала.

Объём реакции

Рабочий объём составляет от 1 до 50 мкл.

Рекомендованный производителем диапазон для большинства задач — 10–25 мкл.

Небольшой реакционный объём позволяет:

• уменьшить расход мастер-микса;
• снизить расход праймеров и зондов;
• экономить исследуемый материал;
• увеличить число исследований из одного набора реагентов.

Для конкретного диагностического набора необходимо использовать объём, установленный его инструкцией.

Температурная система

Нагрев и охлаждение выполняются элементами Пельтье.

Основные характеристики:

• диапазон температур блока — 0–100 °C;
• максимальная скорость изменения температуры — до 5 °C/с;
• средняя скорость — около 3,3 °C/с;
• точность температуры — ±0,2 °C от заданного значения при 90 °C;
• межлуночная однородность — ±0,4 °C в течение 10 секунд после достижения 90 °C;
• нагреваемая крышка — до 105 °C.

Высокая температурная воспроизводимость необходима для стабильного значения Cq и сопоставимости результатов между позициями планшета.

Температурный градиент

CFX96 Touch поддерживает программируемый температурный градиент.

Параметры:

• рабочий диапазон — 30–100 °C;
• программируемая разница температур — 1–24 °C;
• одновременно оценивается до восьми температурных зон по рядам планшета.

Градиент применяется для:

• подбора температуры отжига;
• оптимизации новых праймеров;
• повышения специфичности реакции;
• снижения неспецифической амплификации;
• разработки новых ПЦР-протоколов.

Оптическая система

Оптическая система использует:

• 6 независимо фильтрованных светодиодов;
• 6 фильтрованных фотодиодов.

Регистрация выполняется индивидуально для каждой лунки.

Спектральный диапазон возбуждения и детекции системы составляет приблизительно 450–730 нм.

Твердотельная оптика не требует перемещения планшета относительно блока во время температурного цикла.

Шесть каналов детекции

Оптическая система имеет шесть каналов.

Пять каналов могут использоваться для мультиплексного определения до пяти мишеней в одной пробирке.

Шестой канал предусмотрен в том числе для FRET-приложений.

Система совместима с распространёнными классами флуорофоров, включая:

• FAM;
• SYBR Green;
• HEX;
• флуорофоры спектрального класса Texas Red;
• Cy5;
• дальнекрасные красители класса Quasar 705.

Фактическая совместимость конкретного красителя определяется спектром флуорофора, набором оптических фильтров и методикой тест-системы.

Мультиплексная ПЦР

Система позволяет одновременно регистрировать до пяти аналитических мишеней в одной реакционной ячейке.

Мультиплексирование может применяться для:

• одновременного определения нескольких патогенов;
• внутреннего контроля;
• контроля выделения нуклеиновых кислот;
• дифференциации генотипов;
• одновременной регистрации целевой последовательности и референсного гена;
• панельных молекулярных исследований.

Количество реально используемых каналов определяется конкретной диагностической тест-системой.

Скорость считывания

Стандартное сканирование всех каналов занимает около 12 секунд.

Для одноканальной реакции предусмотрен быстрый режим сканирования приблизительно за 3 секунды.

Fast Scan может применяться, например, для одноканальных реакций с SYBR Green или FAM при условии совместимости протокола.

Динамический диапазон

Производителем заявлен динамический диапазон оптической системы до 10 порядков величины.

Это позволяет работать с образцами, существенно различающимися по исходному количеству матрицы.

Динамический диапазон самого диагностического исследования может быть уже и определяется характеристиками конкретного набора реагентов.

Чувствительность

В спецификации оборудования заявлена возможность регистрации одной копии целевой последовательности на фоне геномной ДНК человека в условиях тестирования производителя.

Этот показатель характеризует технические возможности системы и не является универсальным пределом обнаружения диагностической методики.

Фактический LoD определяется отдельно для каждого:

• набора реагентов;
• типа образца;
• процедуры выделения;
• комбинации праймеров и зондов;
• объёма реакции;
• лабораторного протокола.

Количественный анализ

CFX96 Touch поддерживает количественный анализ с использованием стандартной кривой.

Программное обеспечение позволяет:

• рассчитывать Cq;
• строить стандартные кривые;
• оценивать эффективность амплификации;
• определять исходное количество матрицы;
• сравнивать образцы;
• анализировать технические повторы.

Для абсолютной количественной оценки используются стандарты с известной концентрацией.

Анализ экспрессии генов

Поддерживаются:

• относительное количество по ΔCq;
• нормализованная экспрессия по ΔΔCq;
• использование одного или нескольких референсных генов;
• сравнение экспериментальных групп;
• анализ нескольких файлов экспериментов.

Функциональность зависит от установленной версии программного обеспечения.

Анализ кривых плавления

После амплификации может выполняться melt curve analysis.

Анализ кривой плавления применяется для:

• оценки специфичности продуктов;
• обнаружения неспецифической амплификации;
• выявления праймер-димеров;
• определения температуры плавления;
• предварительного различения продуктов реакции.

Особенно часто режим применяется с интеркалирующими красителями.

HRM

Высокоразрешающий анализ плавления HRM доступен при использовании соответствующего программного обеспечения Precision Melt Analysis и совместимой химии.

HRM может применяться для:

• генотипирования;
• анализа SNP;
• поиска мутаций;
• различения ампликонов;
• исследований метилирования при соответствующей подготовке материала.

HRM является дополнительной функциональностью и не следует считать обязательной частью каждой поставки CFX96.

Аллельная дискриминация

CFX96 поддерживает анализ аллельной дискриминации с использованием соответствующих флуоресцентных зондов.

Метод может применяться для:

• SNP-генотипирования;
• определения известных мутаций;
• различения аллелей;
• молекулярно-генетических исследований.

Диагностическое применение определяется зарегистрированным набором реагентов.

Работа без компьютера

C1000 Touch оснащён интегрированным цветным сенсорным дисплеем.

Основные функции можно выполнять непосредственно на приборе:

• создавать протокол;
• изменять температуры;
• задавать время стадий;
• программировать количество циклов;
• задавать температурный градиент;
• запускать реакцию;
• наблюдать ход амплификации;
• сохранять протоколы.

Для расширенного анализа результатов используется программное обеспечение на компьютере.

Программное обеспечение

Для системы применялись и применяются разные поколения ПО.

В российском РУ в перечне принадлежностей указано CFX Manager Software.

Более современная линейка Bio-Rad использует CFX Maestro Software.

CFX Maestro позволяет выполнять:

• количественный анализ;
• melt curve analysis;
• анализ экспрессии;
• ΔCq;
• ΔΔCq;
• аллельную дискриминацию;
• endpoint analysis;
• статистические сравнения;
• построение графиков;
• экспорт таблиц;
• формирование отчётов.

Для диагностической работы необходимо использовать программное обеспечение и версию, допустимые инструкцией применяемой тест-системы и регистрационной документацией.

CFX Maestro Security Edition

Для лабораторий с повышенными требованиями к управлению данными существует CFX Maestro Security Edition.

Функции регулируемой среды могут включать:

• разграничение доступа;
• управление пользователями;
• защищённую работу с файлами;
• аудит действий;
• функции, предназначенные для упрощения соответствия требованиям регулируемой лаборатории.

Наличие Security Edition зависит от поставки и лицензии.

Экспорт данных

Программное обеспечение позволяет экспортировать:

• числовые результаты;
• таблицы;
• настройки эксперимента;
• графики;
• кривые амплификации;
• melt curves;
• изображения;
• отчёты.

Отчёты могут сохраняться в PDF, а изображения — в распространённых графических форматах.

Медицинское применение

Российская регистрация CFX96 оформлена не как самостоятельное название «CFX96 Touch», а в составе медицинского изделия:

«Термоциклер для амплификации нуклеиновых кислот 1000, с принадлежностями».

Зарегистрированное исполнение C1000 Touch может использовать оптический реакционный модуль CFX96.

Для медицинской диагностики недостаточно только наличия РУ на прибор.

Необходимо, чтобы конкретный набор реагентов:

• имел действующее регистрационное удостоверение;
• прямо допускал работу на CFX96 или эквивалентной системе;
• поддерживал требуемые оптические каналы;
• содержал валидированный температурный профиль;
• определял правила интерпретации результата.

Применение

CFX96 может использоваться для:

• ПЦР в реальном времени;
• ОТ-ПЦР в реальном времени;
• качественного определения ДНК;
• качественного определения РНК;
• количественного определения нуклеиновых кислот;
• исследования экспрессии генов;
• анализа инфекционных маркеров;
• выявления генетических вариантов;
• генотипирования;
• анализа мутаций;
• аллельной дискриминации;
• melt curve analysis;
• мультиплексной ПЦР;
• разработки и оптимизации ПЦР-протоколов.

Подходит для учреждений

CFX96 применяется в:

• ПЦР-лабораториях;
• клинико-диагностических лабораториях;
• молекулярно-генетических лабораториях;
• вирусологических лабораториях;
• микробиологических лабораториях;
• инфекционных стационарах;
• многопрофильных больницах;
• диагностических центрах;
• онкологических учреждениях;
• научно-исследовательских лабораториях;
• университетских лабораториях;
• ветеринарных лабораториях — при применении соответствующих методик;
• лабораториях санитарно-эпидемиологического профиля.вввввввввввввввв